Nat.Neurosci | 小鼠咳嗽样防御行为的迷走神经-脑干内感受回路

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/ 2024.11.01

摘要

咳嗽是一种呼吸行为，在保护呼吸系统中起着至关重要的作用。本研究中，研究者表明小鼠的孤束核（nucleus of the solitary tract，NTS）中含有异质性神经元群体，它们在控制呼吸方面具有不同的作用。在这些亚型中，激活表达神经激肽1（tachykinin 1，Tac1）的神经元会触发特定的呼吸行为，而经过详细表征后，这些行为表现为类似咳嗽的行为。化学遗传学沉默或基因消融Tac1神经元能够抑制由刺激性挑战引起的类似咳嗽的行为。这些Tac1神经元接收来自迷走神经节内支气管肺化学感受和机械感受神经元的突触输入，并协调延髓区域以控制不同方面的咳嗽样防御行为。研究者提出，这些位于NTS的Tac1神经元是控制小鼠咳嗽样防御行为的气道-迷走-大脑神经回路的关键组成部分，它们协调下游模块化回路以引发有力呼气反应的顺序运动模式。

背景

内感知是对身体内部状态的感知， 在多种生理和情绪过程中起着重要作用。来自内脏器官的多种内感知刺激主要与身体运动有关，而咳嗽则通过在强迫呼气之前的深吸气来区分。通常，这两种反射在临床定义的咳嗽发作期间会间歇性地发生，表明这两种相似的呼吸防御行为可能有共同的机制。在病理情况下，这些防御行为的神经回路对有害和无害的刺激变得高度敏感，导致非生产性干咳，严重影响生活质量。实际上，过度干咳是患者就医的最常见主诉之一，也是许多疾病的常见症状，包括2019冠状病毒病（COVID-19）。目前，对过度咳嗽的常见治疗不仅没有比安慰剂更有效，还可能导致药物滥用。缺乏真正有效的镇咳药物主要是因为研究者对介导这些防御反射的细胞和分子途径知之甚少。在这项研究中，研究者发现分子上不同的孤束核（NTS）神经元在光遗传激活时触发了不同的呼吸模式。其中一种模式非常类似于在小鼠和其他物种中观察到的咳嗽样行为。通过结合小鼠遗传学和神经遗传学工具，研究者鉴定出连接气道和脑干的一个具有遗传定义的神经回路，这对于协调这些重要的防御性呼吸行为至关重要。

这些刺激由迷走神经中的感觉神经元感知， 然后通过孤束核等中继区域传递到大脑。呼吸作为一种重要的身体功能，依赖于内感知信息进行适当的调节和调控，动态响应身体内的生理状态和刺激。然而，迷走神经传入纤维和孤束核如何介导不同的呼吸行为尚不清楚。防御性呼气反射（包括咳嗽反射和呼气反射）是清理气道和保护身体免受吸入物质和病原体侵袭的关键功能。通过排出刺激物、粘液或异物，这些反射对维持呼吸系统的健康至关重要。

方法

小鼠

小鼠在12小时明暗交替的光照周期下饲养，食物和水可自由摄取。本研究使用的实验小鼠为8周至32周龄的成年雌性和雄性小鼠。小鼠维持在65–75°F（18–23°C）温度和40–60%湿度的环境中。所有使用的小鼠均为C57BL/6J遗传背景。使用的小鼠品系包括Ai9、Grp-Cre、Tac1-Cre、Trpv1−/− null、Trpv1-Cre、Vglut2 flox、Vgat-Cre、Vglut2-Cre和Tac1−/− null，均已在之前的研究中报道。小鼠被随机分配到每个实验组中。

单细胞RNA测序样本制备

在出生后第5天，将5只小鼠通过吸入异氟烷麻醉后断头处死。取出大脑并将其嵌入人工脑脊液（agarose II in artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中的4%琼脂糖II中，用VT 1000S振动切片机切成200 µm厚的切片。根据形态学特征（相对于最后区、第四脑室和中央管的相对位置）手动解剖尾部NTS组织及邻近的背侧迷走复合体区域，称为NTS。将组织放入A型休眠液中，随后用20 U/ml木瓜蛋白酶消化，并通过巴斯德移液管进行连续轻轻吹打，生成单细胞悬液。细胞在37°C下用0.2% DyeCycle Ruby染色15分钟，然后通过70 µm细胞过滤器。通过BD FACSAria III细胞分选仪使用100 µm喷嘴对活细胞悬液进行分选并收集。荧光激活细胞分选（ fluorescence-activated cell sorting，FACS）样品加载至10x Chromium平台进行捕获。后续的cDNA合成、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）及文库制备均按照制造商的协议进行。在NovaSeq测序仪上进行测序。

呼吸监测和分析

个体小鼠在450毫升的全身体积描记器(whole-body plethysmograph,WBP)腔室中置于室温（22°C）、21%氧气（常氧）或10%氧气（低氧挑战，氮气平衡）环境中。小鼠在记录呼吸参数前被允许在腔室中适应30分钟，随后通过软件记录呼吸参数。

对于辣椒素的咳嗽刺激（咳嗽测试），单只小鼠被放置在经过改装、带有小型麦克风的WBP腔室（Buxco）中。辣椒素（Sigma-Aldrich, 404-86-4）最初溶解于乙醇中，配制成10 mM的储备溶液。该储备溶液随后在生理盐水中进一步稀释至所需浓度。对于聚乙烯醇的鼻腔注入，聚乙烯醇（Sigma-Aldrich, 9002-89-5）溶解于生理盐水中。单只小鼠被注入10 μl的20%聚乙烯醇溶液（每侧鼻孔各5 μl），然后被置于WBP腔室中记录10分钟。对于化合物48/80的鼻腔注入，化合物48/80（Sigma-Aldrich, 94724-12-6）溶解于生理盐水中。单只小鼠被注入15 μl的1 µg µl−1化合物48/80溶液（每侧鼻孔各7.5 μl），随后被置于WBP腔室中进行10分钟记录。腔室中持续通入室内空气。呼吸防御行为被定义为幅度超过前一次正常呼吸150%的事件。咳嗽样反应通过描记法痕迹、胸膜内压力、音频记录及小鼠的动作进行识别。叹息、喷嚏、呼气峰值及其他呼吸模式和音频事件被排除在咳嗽反射和呼气反射的量化之外（扩展数据图4）。注意，每一种呼吸防御行为（例如咳嗽、喷嚏和呼气反射）都通过分类器处理（扩展数据图2），以确保这些事件被正确分类。叹息在描记法痕迹中表现为特征性双相阶梯状，吸气努力的第二阶段气流增强，且事件后的呼气时间延长。呼气峰值在描记法痕迹中被定义为一个没有前驱吸气的尖锐呼气峰值。至少有两名经验丰富的研究人员对行为记录进行独立盲法分析，只有经过两位研究员确认的事件才用于最终量化。对于c-Fos实验，小鼠被置于腔室中并进行30 µM辣椒素的5分钟雾化处理，随后恢复5分钟。在咳嗽刺激挑战后15分钟，收集脑组织并立即将其嵌入OCT中，接着进行RNAscope检测。

对于低氧挑战，小鼠在记录前在WBP腔室中适应30分钟。动物在常氧条件下（21% 氧气）进行10分钟基线记录。基线记录后，动物被暴露于10%氧气的低氧环境10分钟，然后在常氧中恢复10分钟。每次空气条件切换时腔室会用新的空气条件冲洗1分钟。

迷走神经切断术

将麻醉小鼠置于立体定位装置上，将麻醉状态维持在1.5%异氟醚以下。手术前用聚维酮剃掉脖子并用酒精消毒。在颈部做一个1cm的中线切口，暴露气管和迷走神经。使用钝镊子小心地将结节神经节与结缔组织分离，并在结节神经节的远端神经处单侧进行迷走神经切断术。曾在其他物种上应用单侧迷走神经切断术，因为双侧迷走神经切断术对肺功能有害。

结果

表征小鼠的呼吸防御行为

尽管小鼠是研究生理学和行为的遗传和分子基础的广泛使用的哺乳动物模型，但小鼠各种呼吸防御行为的进化保守性仍无定论。为了研究小鼠是否表现出呼吸防御行为，研究者首先采用了辣椒素的雾化处理（图1a）这种从辣椒中提取的咳嗽诱发剂在人体和其他物种中均能稳定地引起咳嗽反应，且可能诱发其他呼吸防御反射。对这一刺激的反应中，研究者观察到呼吸事件表现为向上的峰值（图1b–e），类似于通过Tac1-Cre激活所引发的呼吸反应（扩展数据图1o）。这一向上的峰值可归因于呼吸系统在封闭气道下的压力增大（另见下文）。在这一阶段的肌肉压缩将空气吸入WBP腔室中，产生向上的气流轨迹，这是压缩阶段的特征。因此，小鼠在辣椒素刺激下表现出呼吸防御行为。

a，显示WBP腔室的示意图。b，顶部，辣椒素雾化3分钟（灰色）和之后3分钟咳嗽的栅格图。底部，咳嗽率;阴影区域，S.E.M. N = 10只小鼠。c，辣椒素诱发咳嗽的呼吸痕迹和声音（b中的红色刻度线）。d，c的放大描绘，显示三个咳嗽阶段：吸气型（I）、压迫型（C）和排出型（E）。e，辣椒素诱导咳嗽的个体（灰色）和平均（黑色）痕迹（n = 30，三只小鼠）。f，NTS Tac1神经元的光遗传学激活示意图。g，光刺激后咳嗽的栅格图（蓝色三角形，15ms）;呼吸痕迹（红色刻度线）在H中描绘（n = 20,5只小鼠）。h，NTS Tac1神经元激活后咳嗽的呼吸痕迹和声音。i，h的放大描绘。j，光遗传学诱导的咳嗽样行为的个体（灰色）和平均（黑色）痕迹（n = 30，三只小鼠）。k，在上气吸气期间激光命中时从激光开始到压缩峰的时间（n = 32，三只小鼠）与上气呼气（n = 79，三只小鼠;P = 0.0002，双尾Mann-Whitney检验）。辣椒素（咳嗽，n = 85）、NTS Tac1神经元的光激活（光激活，n = 30）与真肺呼气（n = 30）相比，辣椒素诱导的咳嗽的压迫期持续时间（l）和振幅（m）（P = 0.0191咳嗽与光激活，P = 0.0001咳嗽与真肺呼气，P = 0.0001光激活与真肺呼气（l）;P = 0.2109、0.0001、0.0001英寸）。n，o，辣椒素诱导的咳嗽的持续时间（n）和振幅（o），NTS Tac1神经元的光激活（光激活， n = 30），与真肺吸气（n = 30）相比（P = 0.0913，P = 0.0491，P = 0.0005 在 n 中; P = 0.4665，P = 0.0001，P = 0.0001在o中）。对于l-n，使用Kurskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验。p，对照小鼠对激光刺激无反应。q，对照小鼠（n = 30，三只小鼠）光激活后的个体（灰色）和平均（黑色）轨迹。r，注射ChR2（n = 20,5只小鼠）和eYFP（n = 20,3只小鼠）的小鼠诱导呼吸反应的概率（P = 0.0001，Mann-Whitney检验）。数据以s.e.m. NS ±平均值表示，不显著。

NTS Tac1神经元的消融或沉默可抑制咳嗽

为了确定这些NTS中的Tac1神经元在生理条件下是否对咳嗽功能起作用，研究者首先通过染色脑干切片的即早基因c-Fos，检测这些神经元是否被诱发类似咳嗽行为的咳嗽刺激激活。多重单分子荧光原位杂交的结果显示，在10分钟的辣椒素咳嗽刺激后，尾部NTS中c-Fos阳性神经元显著增加（图2a–c），其中c-Fos和Tac1双阳性神经元相较于对照组增加了三倍（图2d）。接近一半的Tac1阳性NTS神经元被c-Fos标记（图2e）。相反，Tac1阴性的NTS群体中c-Fos阳性神经元并未显著增加（图2f）。综上所述，这些结果表明，NTS中的Tac1神经元在咳嗽刺激下优先被激活。

a，b，来自a中受控和肌肉攻击下小鼠的NTS脑区的多重单分子原位杂交（RNAscope），探测Tac1（绿色）和c-Fos（红色）。箱形区域被放大并以a'和b'显示。蓝色，DAPI。箭头，Tac1和c-Fos阳性细胞。AP，rema区。c，对照（n = 4 只小鼠）与实验（n = 4 只）小鼠（P = 0.02，双尾未配对 t 检验）中c-Fos阳性神经元的定量。平均值± semd中对照（n = 4 只小鼠）与实验（n = 4只小鼠）小鼠（P = 0.02，双尾未配对t检验）中c-Fos和Tac1双阳性神经元的定量。平均值 ± sem，对照（n = 4只小鼠）与实验（n = 4只小鼠）小鼠（P = 0.0003，双尾未配对t检验）中c-Fos阳性的Tac1神经元的百分比。与对照组相比，实验小鼠的c-Fos和Tac1双阳性细胞增加有统计学意义。s.e.m. f ±平均值，c-Fos阳性的Tac1阴性细胞的定量。请注意，对照（n = 4只小鼠）和实验 （n = 4只）小鼠（P = 0.07，双尾未配对t检验）之间没有差异。均值 ± s.e.m. NS，不显著。

为了探究NTS中的Tac1神经元在介导由咳嗽刺激引起的类似咳嗽反应中是否至关重要，将AAV-DIO-taCasp3立体定向注射到Tac1-Cre小鼠的NTS中，以基因方式消融Tac1神经元（图3a）。四周后，与注射对照病毒的小鼠相比，NTS中的Tac1神经元显著减少（图3b）。注射并未影响NTS周围区域中Tac1神经元的数量。随后，将小鼠置于WBP腔室中并暴露于咳嗽刺激剂的雾化环境中。在Tac1神经元被基因消融的小鼠中，对辣椒素（图3c）或柠檬酸（图3d）气溶胶的类似咳嗽反应显著减少，这表明Tac1神经元在介导由咳嗽刺激引起的类似咳嗽反应中至关重要。然而，在常氧和低氧环境下，它们的正常呼吸和叹息行为未受到影响（图3e）。这些结果表明，NTS中的Tac1神经元专门用于介导由咳嗽刺激引起的类似咳嗽行为。

a，显示Tac1-Cre小鼠NTS中Tac1神经元遗传消融的示意图。b，小鼠NTS脑切片显示基因消融后Tac1-Cre小鼠中Ai9神经元的缺失。请注意，NTS腹侧神经元的标记是Tac1-Cre发育表达的结果。c，定量Tac1-Cre小鼠在消融前（前）和后（后）辣椒素6分钟粘液攻击中的咳嗽样行为（n = 11 只小鼠;P = 0.0002，双尾配对t检验）。平均值 ± semd，消融前（前）和之后（后）柠檬酸6分钟咳嗽攻击中咳嗽样行为的量化（n = 3只小鼠;P = 0.04，双尾未配对t检验）。平均值 ± s.e.m. e，在常氧（21%O）中消融NTS Tac-1神经元（消融，n = 11）和对照动物（对照，n = 7）的呼吸频率(2)由N平衡(2)）和缺氧（10%O(2)由N（2）平衡.对于常氧，P = 0.86，双尾未配对t检验。对于缺氧，P = 0.92，双尾Mann-Whitney检验。平均值 ± s.e.m. f，示意图显示了Tac1-Cre小鼠NTS中Tac1中hM4Di的表达。g，小鼠NTS脑切片显示Tac1-Cre小鼠中hM4Di-mCherry的表达。h，在有（+，n = 12）和无（−，n = 6，注射AAV-DIO-mCherry）的Tac-1神经元（Tac1-hM4Di）中辣椒素6分钟咳嗽攻击中咳嗽样行为的定量用（+）和没有（+）和没有（-，仅载体）CNO注射。对于对照小鼠，P = 0.65，双尾配对t检验。对于实验小鼠，P = 0.002，Wilcoxon匹配对符号秩检验。平均值 ± s.e.m. i，在用（+）和没有（+）和没有（-，仅载体）CNO注射的Tac-1神经元（Tac1-hM4Di）中具有（+，n = 5）和无（−，仅载体）hM4Di表达的小鼠在常氧和缺氧条件下的叹息率。对于对照小鼠，P = 0.50，常氧时双尾配对t检验，缺氧时P = 0.42，双尾配对t检验;对于实验小鼠，常氧时P = 0.54，双尾配对t检验，P = 0.13，缺氧时双尾配对t检验。均值 ± s.e.m. AP，极后区;NS，不显著。

TRPV1是辣椒素诱导的咳嗽样行为所必需的

延髓孤束核（NTS）是一个大脑中继中心，介导来自内脏器官（包括气道）的内感信号，接收来自迷走神经感觉神经元的传入输入，这些神经元的细胞体位于迷走神经节。瞬时受体电位阳离子通道V1（Transient receptor potential cation channel subfamily V member1，Trpv1），即辣椒素的受体，在一部分迷走神经感觉神经元中表达，这些神经元会因气道中的辣椒素刺激而被激活。因此，研究者假设辣椒素诱导的类似咳嗽反应是通过迷走神经节中的Trpv1神经元介导的。为了探究Trpv1在咳嗽介导中的作用，研究者测试了Trpv1敲除小鼠对辣椒素咳嗽刺激的反应。结果表明，在Trpv1缺失小鼠中，对辣椒素气溶胶的类似咳嗽反应消失了（图4a），这表明Trpv1受体在介导辣椒素诱导的类似咳嗽反应中是必不可少的。

a，量化Trpv1中响应6分钟咳嗽攻击的咳嗽样行为(−/−) (n = 13）和对照（n = 9）小鼠（P = 0.0001，双尾Mann-Whitney检验）。均值 ± semb b，投射到NTS的迷走神经Trpv1神经元逆行追踪方案。c，迷走神经节切片显示结节神经节中逆行标记的神经元（tdTomato）。这些神经元中的许多由结节标志物Phox2b标记。d，定量结节（灰色）和颈静脉（白色）（n = 795个神经元）中AAV逆转录标记的细胞数量。e，气管的横截面，显示投射到NTS的Trpv1神经元的过程。e′，从e开始扩大的方框区域。f，具有Trpv1神经元神经支配的肺叶整张图像（红色）。f′，从f扩大的框区域。g，肺实质中Trpv1神经元（红色）的神经支配。h，远端气道中Trpv1神经元（红色）的过程。i，追踪突触前NTS Tac1神经元的迷走支气管肺神经元的方案。j，定量表达Phox2b（灰色）的FB标记细胞和不表达Phox2b（白色）（n = 99个神经元）的细胞数量。k，探测Egfp、Trpv1和Phox2b的迷走神经节切片的多重原位杂交。蓝色，FB。l，m，来自k的单个神经元被FB、Egfp、Trpv1和Phox2b标记。

NTS Tac1神经元直接由迷走神经神经元支配

研究者假设Trpv1阳性肺迷走神经神经元位于咳嗽回路中NTS Tac1神经元的上游。为了验证这一假设，研究者首先将AAV载体（AAV-DIO-tdTomato） 注射到Trpv1-Cre小鼠的迷走神经节复合体中，以标记迷走神经Trpv1阳性神经元并追踪它们的投射。4周后，在迷走神经节中用tdTomato标记迷走神经感觉神经元的一个子集，它们全部（100%，n = 285 来自三只小鼠）在神经节复合体的一侧发现，神经元表达Phox2b，Phox2b是结节神经元的标志物。在大脑中，在同侧NTS中发现了tdTomato标记的过程，其中一些过程穿过中线到达对侧NTS，与最近在小鼠中的一项研究一致。在外围，在整个气道中发现了tdTomato标记的突起。因此，研究结果表明，迷走神经节中的Trpv1神经元作为一个群体投射到NTS和气道。

其次，为了检验Trpv1支气管肺迷走神经是否支配NTS，将逆行AAV载体AAVretro-DIO-tdTomato注射到Trpv1-Cre小鼠的NTS中，来标记支配Trpv1阳性迷走神经的NTS（图4b）。注射4周后，在迷走神经节中发现tdTomato阳性神经元（图4c）。几乎所有神经元都位于神经节复合体的结节侧，该神经节复合体包含对 Phox2b 呈阳性的神经元（99%，n = 来自三只小鼠的795个神经元）。追踪它们的外周过程，研究者发现这些tdTomato阳性神经元支配气管、肺和远端气道（图4e-h），表明单个Trpv1阳性支气管肺迷走神经感觉神经元将气道连接到NTS。

接下来，为了检验NTS Tac1神经元的潜在迷走神经传入，研究者使用了来自NTS Tac1神经元的狂犬病逆行单突触示踪。通过立体定向注射AAV-CMV-FLEX-TVA-2A-oG，辅助基因TVA受体和狂犬病病毒包膜糖蛋白首先在NTS Tac1神经元中以Cre依赖性方式表达进入Tac1-Cre小鼠的NTS。这使得EnvA假型、糖蛋白缺失的狂犬病病毒（glycoprotein-deleted rabies virus，RVdG）能够从表达Tac1的神经元中特异性感染和单突触传播。在迷走神经节中发现了狂犬病标记的神经元，几乎所有（98.6%;n = 216 个神经元）位于结节神经节中。为了追踪支气管肺迷走神经神经元，将逆行示踪剂Fast Blue（FB）注射到气管中，并与狂犬病病毒示踪相结合（图4i）。一半的狂犬病标记神经元被FB共标记 （49% ± 14%，n = 4只小鼠），表明Tac1神经元接收来自支气管肺区域的迷走神经传入神经。多重单分子RNA原位杂交结果显示，大多数FB标记的神经元（76.8%;n = 99个神经元）是由Phox2b mRNA探针标记的结节神经元（图4j-m），这与支气管肺迷走神经感觉神经元优先位于结节神经节的结果一致。此外，Egfp和FB双阳性的迷走神经感觉神经元也表达Trpv1（图4l，m）。

由于NTS Tac1神经元的化学遗传沉默显著降低了鼻后滴漏诱导的咳嗽样反应，研究者接下来试图检验这些神经元也接收来自机械感觉迷走神经神经元的直接输入的假设。事实上，机械感受器基因 Piezo2在NTS Tac1神经元突触前的支气管肺迷走神经感觉神经元中表达。

总而言之，这些结果表明NTS Tac1神经元直接受迷走神经节中支气管肺化学感应和机械感应迷走神经神经元的支配。

NTS Tac1神经元协调用于咳嗽的电路模块

由于NTS Tac1神经元的激活足以诱导咳嗽样反应，因此这些神经元可以充当中继节点，将肌肉感觉输入传递到大脑，也可以作为咳嗽中枢模式生成器的一部分，控制咳嗽的阶段和时间。为了区分这些假设，研究者首先通过注射编码膜GFP和突触素-mRuby的AAV载体来标记Tac1-Cre小鼠NTS中的突触前末端（AAV-hsyn-FLEX-mGFP-2A-Synaptophysin-mRuby）来绘制NTS Tac1神经元的投影模式。4周后，研究者观察到Tac1神经元在腹外侧延髓中的投射和突触前末梢，其中关键的咳嗽控制神经元特别是在模糊核（nucleus ambiguus，NA）和Bötzinger复合体（Bötzinger complex，BötC）中观察到强大的神经支配（图5a）;以下称为para-NA），其中控制声门的运动核和呼吸控制神经元位于其中，以及呼气前运动神经元所在的尾腹呼吸组（caudal ventral respiratory group，cVRG）（图5h）。

a、para-NA中Tac1神经元的过程（绿色）和突触前末梢（红色）。ChAT，胆碱O-乙酰转移酶，模糊核的标志物。b，NTS Tac1神经元的光遗传学激活para-NA过程示意图。c，d，（c）和（d）NA末端激活之前和之后的声带快照。红线，测量的距离。e，激光激活前（关）和期间（开）声带之间的归一化距离（n = 6;P = 0.0001，双尾配对t检验）。f，para-NA过程的15毫秒光刺激后的呼吸轨迹和呼吸轨迹音频。向上的峰值表示由于声门闭合而受到压缩。g，f的放大描绘。h，cVRG中Tac1神经元的过程（绿色）和突触前末梢（红色）。i，NTS Tac1神经元的光遗传学激活cVRG过程示意图。j，k，（j）和（k）cVRG激活前后声带快照。l，激光激活前（关）和期间（开）声带之间的归一化距离（n = 10;P = 0.82，双尾配对t检验）。m，cVRG过程15毫秒光刺激后的呼吸轨迹和呼吸轨迹音频。n，m的放大描绘。向上峰值表示由于声门保持打开状态而导致的过期。o，对于NA末端激活（n = 17，三只小鼠）和cVRG末端激活（n = 26，三只小鼠），从激光开始到初始上升峰值之间的时间。p，在ChR2注射小鼠中诱导NA末端激活（n = 14,3只小鼠）和cVRG末端激活（n = 15,3只小鼠）呼吸反应的概率。q，在手术前（前）和手术后（后）辣椒素6分钟打喷嚝中，实验小鼠（n = 3）的咳嗽次数（P = 1，双尾配对t检验）、打喷嚏（P = 0.75，双尾Wilcoxon匹配对符号秩检验）和叹息次数（P = 0.99，双尾Wilcoxon 匹配对符号秩检验）。r，逆行电路跟踪原理图。s，NTS的脑干切片显示逆行 AAV 注射到cVRG（绿色）和 para-NA（红色）中的Tac1-Cre神经元。填充箭头，由两个AAV标记的神经元;打开箭头，仅由一个AAV标记的神经元。AP，极后区;10N，迷走神经的背侧运动核。t，双标记神经元与任一AAV标记的神经元总数之比的定量（n = 4只小鼠）。数据以s.e.m. NS ±平均值表示，不显著。

讨论

结果显示，NTS包含具有不同功能的分子异质性神经元群体，负责控制多样化的呼吸模式。其中，一个表达Tac1的NTS神经元群及其相关的神经回路对小鼠的类似咳嗽行为至关重要。研究者证明小鼠在接触咳嗽刺激剂后表现出类似咳嗽的行为，而这些NTS Tac1神经元在NTS中优先被咳嗽刺激激活。通过光激活这些神经元会引发带有强制呼气的刻板类似咳嗽反应，而基因消融或化学遗传沉默这些神经元会减弱对咳嗽刺激剂的类似咳嗽反应，而对其他呼吸模式影响较小。这些控制咳嗽的神经元直接接收来自支配气道的化学感受和机械感受迷走感觉神经元的突触输入，并投射至腹外侧延髓以引发小鼠的类似咳嗽防御行为。该过程主要通过Tac1神经元释放谷氨酸来介导，而不是通过Tac1基因编码的神经肽。研究者得出结论，该神经回路连接气道与腹侧脑干，在控制小鼠的类似咳嗽行为中起着关键作用（图6a）。此外，研究发现NTS Tac1神经元投射到特定的延髓区域，且在这些区域对这些末梢进行光激活会引发整合的类似咳嗽行为的不同但互补的组成部分（图6b）。

a，咳嗽控制电路的模型。气道中的辣椒素刺激激活Phox2b阳性迷走神经节感觉神经元（Trpv1阳性或Piezo2阳性），这些神经元直接在NTS中的Tac1阳性神经元上形成突触，进而投射到腹外侧髓质中的para-NA区域和cVRG区域释放谷氨酸以引发咳嗽样行为。b，NTS通过迷走神经传入神经接收不同的内感受刺激。NTS中的Tac1神经元被化疗-镇咳和机械-镇咳刺激激活，并协调不同的髓质回路模块（即para-NA和cVRG）以控制咳嗽样行为的不同运动阶段。咳嗽样行为包括压迫期和排斥期。Tac1神经元-para-NA回路控制压缩期，而Tac1神经元-cVRG回路控制排出期。

迷走神经背侧核（NTS）被认为是接受迷走神经传入信号以调节呼吸反射的主要部位。研究者的结果不仅展示了NTS不同亚群的多样化呼吸反应，还突显了NTS中Tac1神经元在小鼠类似咳嗽行为中的关键作用，强调了NTS在呼吸控制中的重要功能。进一步详细研究这些NTS神经元与其他延髓区域的潜在相互作用可能会揭示更多与咳嗽相关的神经环路成分。尽管咳嗽反射和呼气反射都包含压缩和排出阶段，并且在临床上经常间歇性发生，但这两种重要的气道防御功能之间的关系尚未完全了解。研究结果表明，这两种反应均需通过NTS中的Tac1神经元共享的神经回路实现，因为当这些神经元被沉默或消融时，两种行为均有所减少。此外，激活不同腹侧延髓区域的NTS Tac1神经元末梢会引发咳嗽样行为的不同运动方面，这表明从这些NTS Tac1神经元延伸的模块化回路具有分化性组织，用于控制呼气努力的连续运动模式。未来的实验将需要进一步阐明协调这些运动输出的机制。

与小鼠模型的研究一致，结果表明，小鼠对咳嗽刺激表现出刻板的行为反应，这些刺激在人体和其他物种中触发咳嗽反射和呼气反射。此外，小鼠这些行为的特征，包括呼吸气流波形、胸膜内压力变化、肌肉活动、声带闭合、尖锐的声音和身体运动，都类似于其他物种的类似咳嗽行为。这些结果共同表明，类似咳嗽的行为是一种保护肺部的进化保守功能。尽管像这样的基本防御功能在不同物种间保守是合理的，但可能仍存在一些进化上的差异。例如，副三叉神经核已被证明在其他物种中接收来自气道的传入信号；然而，几项针对小鼠的最新研究显示，该神经核在小鼠中不存在气道传入信号。尽管人类与其他物种之间的类似咳嗽行为可能存在尚未发现的差异，但本文确定的神经回路在小鼠观察到的原始咳嗽样行为中起着关键作用。进一步的研究需要深入了解这些基本呼吸行为及其潜在的神经回路在不同物种间的进化过程。

参考文献

声明

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https://www.jmptonline.org/article/S0161-4754(24)00069-1/abstract

3.Transcutaneous auricular vagus nerve stimulation improves cognitive decline by alleviating intradialytic cerebral hypoxia in hemodialysis patients: A fNIRS pilot study

经皮耳迷走神经刺激通过缓解血液透析患者的透析中脑缺氧来改善认知能力下降：一项 fNIRS 初步研究

https://www.cell.com/heliyon/fulltext/S2405-8440(24)15872-0

4.Non-Invasive Vagus Nerve Stimulation in Anti-Inflammatory Therapy: Mechanistic Insights and Future Perspectives

抗炎治疗中的无创迷走神经刺激：机制见解和未来展望

https://www.frontiersin.org/journals/neuroscience/articles/10.3389/fnins.2024.1490300/abstract

5.Vagus nerve stimulation in Parkinson’s disease: a scoping review of animal studies and human subjects research

帕金森病中的迷走神经刺激：动物研究和人类受试者研究的范围综述

https://www.nature.com/articles/s41531-024-00803-1

6.Transcutaneous Vagus Nerve Stimulation Boosts Post-Error Accuracy During Perceptual Decision-Making

经皮迷走神经刺激提高感知决策过程中的误差后准确性

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.10.21.619457v1.abstract

7.Magnetic vagus nerve stimulation ameliorates contrast-induced acute kidney injury by circulating plasma exosomal miR-365-3p

磁性迷走神经刺激通过循环血浆外泌体miR-365-3p改善造影剂诱导的急性肾损伤

https://link.springer.com/article/10.1186/s12951-024-02928-0

8.First-in-human microelectrode recordings from the vagus nerve during clinical vagus nerve stimulation

在临床迷走神经刺激期间首次在人体中记录迷走神经的微电极

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/epi4.13083

9.Transcutaneous auricular vagus nerve stimulation mitigates gouty inflammation by reducing neutrophil infiltration in BALB/c mice

经皮耳迷走神经刺激通过减少BALB/c小鼠的中性粒细胞浸润来减轻痛风炎症

https://www.nature.com/articles/s41598-024-77272-2