文献速递 | 迷走神经刺激介导神经免疫调节改善多发性硬化症

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/ 2024.10.25

摘要

多发性硬化症（Multiple sclerosis，MS）是一种脱髓鞘性中枢神经系统（central nervous system，CNS）疾病，与功能障碍和累积残疾有关。美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的多种药物可有效抑制炎症和减缓残疾进展。然而，这些药物不是对所有患者都有好的治疗效果，可能和副作用有关。迷走神经（vagus nerve，VN）在CNS和外周之间提供直接的通信通路，通过电刺激VN（VNS）调节炎症反射显示出改善多种CNS和自身免疫性疾病病理的有效性。因此，研究者研究了VNS对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）MS模型的影响。在这项研究中验证VNS介导的神经免疫调节可有效降低EAE疾病的严重程度和持续时间、中性粒细胞和病原淋巴细胞的浸润、髓鞘损伤、血脑屏障破坏、纤维蛋白原沉积和促炎性小胶质细胞活化。VNS调节与MS发病机制有关的基因表达，以及编码髓鞘蛋白和调节新髓鞘合成的转录因子的基因表达。总之，结果表明通过VNS进行神经免疫调节可能是治疗MS的一种很有前途的方法，它不仅可以改善症状还可以促进髓鞘修复（髓鞘再生）。

实验材料和方法

刺激设备植入

参考已有的成熟技术手段，亚急性至慢性植入方法：用异氟醚（3%诱导，2至2.5%维持）和脱毛消毒制备的切口部位（聚维酮碘溶液和70%异丙醇）麻醉大鼠。大鼠仰卧位，通过1cm内侧切口分离左侧VNS。然后将大鼠俯卧放置，并在背侧皮肤上做1.5至2cm的切口。使用钝剪刀将皮肤与皮下组织分开，形成一个用于接收刺激设备的口袋。在口袋和颈部切口之间形成一个用于导线的皮下隧道。该设备位于背侧皮肤下，并用不可吸收的尼龙缝合线固定。将电极袖带轻轻拉过隧道并固定在左侧VNS周围。伪刺激的大鼠以相同的方式植入，但伪刺激设备没有末端电极袖带。用手术缝合器缝合切口。给大鼠局部麻醉然后放在加热垫上，直到胸骨躺位恢复。术后3天给予镇痛剂。

被植入的VNS设备的照片。该完全植入设备由一个实验性临床设备的脉冲发生器组成，并附加一个定制的双极cuff电极。脉冲发生器被固定在大鼠背部的皮下筋膜上，电极通过隧道固定到左侧迷走神经周围。

EAE诱导和VNS

神经刺激设备植入后6至7天，在急性麻醉下（异氟醚，3%）通过注射（sc）豚鼠髓鞘碱性蛋白（gpMBP）的乳化肽诱导EAE(69-88)，100 μg/大鼠+完全弗氏佐剂;Hooke实验室，劳伦斯，马萨诸塞州）进入后腿背侧（100μL/侧）。此时，设备植入的所有手术钉也被移除。免疫接种后7天（d post-EAE induction，DPI;EAE症状出现的大致日期），开始每日VNS刺激（1mA、10Hz、60s、0.25ms 脉宽、TID）并持续到21DPI 或安乐死日。疾病对照组的大鼠在EAE诱导前未接受任何操作。

体重和临床评分记录

根据标准评分指南（Hooke Laboratories，Lawrence，MA），以盲法方式记录基于可观察到的疾病症状（从0-无症状到5-垂死或死亡）的临床评分。记录体重从0到21DPI。

结果

VNS可降低EAE的疾病严重程度和持续时间

为了研究VNS是否能有效降低EAE的严重程度和持续时间，每天使用植入设备进行的大鼠（1mA，60s，TID），从EAE诱导后7天开始（DPI），即EAE症状出现的大致日期，到第21天DPI（图1A）。为了分析分组数据，将个体动物重新基线至症状发作后一天（day post symptom onset，DPSO）。与Sham（植入设备，无刺激）和未植入疾病对照大鼠相比，VNS显著降低了EAE疾病的严重程度和持续时间 （图1B;通过双向混合模型方差分析：治疗 P = 0.005，DPSO P < 0.0001）。VNS显著减轻了EAE疾病的严重程度和持续时间，如代表曲线下面积的数据所示（AUC = 临床评分 X 症状天数;图1C;均值 ± SEM;疾病控制 = 14.88 ± 0.80，Sham = 13.50 ± 0.76，VNS = 9.45 ± 1.01，P = 0.0013 vs. Sham），最高临床评分（图1D;平均 ± SEM：疾病控制 = 3.72 ± 0.17，Sham = 3.36 ± 0.13，VNS = 2.4 ± 0.31，P = 0.0005 vs. Sham）和症状天数（图1E;平均 ± SEM：疾病控制 = 7.13 ± 0.35，Sham = 7.95 ± 0.19，VNS = 6.30 ± 0.26，P = 0.0001 vs. Sham）。与疾病严重程度和持续时间的降低一致，VNS改善了在Sham和疾病对照大鼠中观察到的体重减轻（通过双向方差分析：治疗 P = 0.003，DPSO P < 0.0001）。此外，VNS介导的对EAE疾病严重程度和持续时间的抑制程度与 FDA 批准的3 mg/kg/d口服 MS 药物特立氟胺所达到的效果没有显著差异（± SEM 的AUC平均值：载体 = 14.38 ± 1.43,1 mg/kg/天特立氟胺 = 12.75 ± 1.64,3 mg/kg/天特立氟胺 = 7.00 ± 2.10，VNS = 9.45 ± 1.01，P = 0.594 vs. 3 mg/ kg/天特立氟胺）。

图1。VNS可减轻EAE的症状和持续时间。（A）植入、免疫和VNS治疗的示意图。VNS设备在第-7天植入，大鼠在第0天用MBP免疫。每日VNS治疗从第7天开始，一直持续到第21天。EAE症状大约在第7天和第8天发作。（B）随时间变化的临床评分（症状出现后天数;DPSO）的数据以IQR±中位数表示，并将每日组中位数与Kruskal-Wallis检验进行比较。*P < 0.05，**P < 0.01。Sham和疾病控制的效果通过（C）曲线下面积、（D）最大临床评分和（E）症状总天数来量化。（B）通过双向混合模型方差分析（自变量：治疗、DPSO）比较组均值。（C-E）通过方差分析比较组均值，然后通过Tukey多重比较检验进行比较。**P < 0.01，***P < 0.001，******P < 0.0001。

VNS在疾病高峰期减少EAE脊髓（SC）中的炎性病变形成和脱髓鞘

为了探索VNS介导的疾病严重程度和持续时间降低的潜在机制，利用组织化学分析来评估VNS、和naive大鼠腰椎SC在3至4天DPSO（峰值EAE）的炎症病变和脱髓鞘[图2]。正如预期的那样，苏木精和伊红（hematoxylin and eosin, H&E）或Luxol固色蓝（Luxol fast blue, LFB）与核固红（nuclear fast red, NFR）染色在naïve大鼠SC中没有发现异常（图2A和B）。3至4 DPSO的H&E染色显示，与在Sham大鼠的白质（white matter, WM）和灰质（gray matter, GM）SC区域（箭头）中观察到的升高水平相比，VNS使总炎症病变面积减少了49%（图2A和C;平均%Sham ± SEM：Sham = 100.00 ± 28.36，VNS = 51.33 ± 19.20，Naïve = 0.00 ± 0.00;n = 每组3至 4;Sham vs. VNS：P = 0.33， Sham vs. Naïve：P = 0.04， VNS vs. Naïve：P = 0.34）。这些众多的WM和GM病变区域与细胞浸润共定位，提供了VNS阻止病变相关免疫细胞浸润的证据（图2A）。症状高峰期的LFB染色显示，与FAM相比，VNS使WM的脱髓鞘程度降低了44%，观察到的几个VNS SC节段完全没有可察觉的脱髓鞘（图 2 B 和 D;SEM ±平均 % Sham：Sham = 100.00 ± 20.35，VNS = 55.72 ± 15.55，Naïve = 0.00 ± 0.00;n = 每组 3 至 4;Sham vs. VNS：P = 0.20， Sham vs. Naïve：P = 0.0085， VNS vs. Naïve：P = 0.13）。在 0 至 2 DPSO（恶化的EAE）和5至7 DPSO（缓解的EAE）时间点时，Sham大鼠与VNS和naïve大鼠的细胞浸润相关病变和脱髓鞘水平也较高。

图2。VNS在疾病高峰期减少EAE SC中的炎性病变形成和脱髓鞘。在疾病高峰期收获的3微米腰椎SC切片用H&E或LFB与NFR（LFB & NFR）染色，以分别显示含有细胞浸润和WM脱髓鞘的炎性病变。显示了代表性部分。（A）H&E显示 VNS可防止WM和GM区域炎性病变（箭头）的形成。（B）与Sham大鼠相比，在VNS的WM区域观察到髓鞘丢失减少（箭头）。（A和B）在幼稚大鼠中未观察到明显的炎症病变或髓鞘丢失。（C和D），炎症病变和脱髓鞘面积的量化。数据以均值± SEM 表示。组均值（n = 3 至 4）通过与Tukey检验校正多重性的方差分析进行比较。*P < 0.05，**P < 0.01。平均Sham病变面积 = 73,030 μm(2).平均Sham脱髓鞘面积 = 51,800 μm(2).WM， 白质;GM，灰质。

VNS抑制星形胶质细胞的活化，保持BBB完整性，并限制纤维蛋白原在EAE峰值时的沉积

进行免疫荧光研究以研究星形胶质细胞活化、血脑屏障（BBB）破坏和纤维蛋白原实质沉积的存在。用神经胶质纤维酸性蛋白 （glial fibrillary acidic protein，GFAP）染色询问EAE期间BBB不稳定的星形胶质细胞活化的程度。在整个GM和WM区域，Sham组相对于VNS显示更高的GFAP表达（图3A和C）。GFAP染色的减少表明VNS降低了星形胶质细胞活化 （GFAP平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI） 归一化为 Sham：Sham = 1.00 ± 0.05，VNS = 0.407 ± 0.1，朴素 = 0.388 ± 0.15;Sham vs. VNS：P = 0.0006， Sham vs. Naïve：P = 0.0005， VNS vs. Naïve：P = 0.98）。VNS以明确的网状外观维持CNS内皮紧密连接蛋白claudin-5的分布，这与在Sham中观察到的表达失调形成鲜明对比（图3B）。血浆蛋白纤维蛋白原的CNS实质沉积在Sham SC段中高度明显（图3B和D），在WM和GM中均升高，偶尔与内皮细胞标志物claudin-5和CD31破坏区域共定位（图3C）。相比之下，纤维蛋白原的明显沉积在VNS SC中很少（图3B和D），VNS中纤维蛋白原染色的密度与Sham SC相比显著降低（平均值归一化为 Sham ± SEM：Sham = 1.00 ± 0.22，VNS = 0.17 ± 0.04，Naïve = 0.04 ± 0.03;n = 3;Naïve vs. VNS：P = 0.010， Sham vs. Naïve：P = 0.005， VNS vs. Naïve：P = 0.79）。总之，这些数据表明VNS治疗抑制星形胶质细胞活化，保持BBB的完整性，并限制纤维蛋白原沉积到CNS实质中。

图3。VNS抑制星形胶质细胞的活化，保持BBB完整性并限制纤维蛋白原在EAE峰值时的沉积。（A）naive和EAE大鼠腰椎SC切片的代表性40X共聚焦图像，免疫标记星形胶质细胞标志物GFAP作为炎症指标。（B）炎性血浆蛋白纤维蛋白原和紧密连接蛋白claudin-5染色的腰椎SC切片的代表性63X共聚焦图像。（C）GFAP MFI的定量显示VNS处理后GFAP表达显著下调，与幼稚动物的水平相当。（D）VNS显著减少纤维蛋白原沉积并保持CNS中的密蛋白5结构完整性。数据表示为单个焦点整合的积分密度（归一化为Sham）以及均值 ± SEM。组均值（n = 3）通过多重性校正的方差分析与Tukey检验进行比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

VNS抑制巨噬细胞/小胶质细胞的激活，并在EAE峰值时将其表型转向分辨率

通过用促炎“M1”表型标志物iNOS和抗炎/促消解“M2”表型标志物CD206共标记小胶质细胞/巨噬细胞标志物Iba1，进行免疫荧光研究，研究病灶邻近和病灶远端小胶质细胞/巨噬细胞的激活状态。与Sham大鼠相比，VNS中EAE疾病高峰期Iba1面积显著降低（平均Iba1面积分数（%）：Sham = 6.462 ± 0.898，VNS = 1.562 ± 0.411;n = 3，P = 0.008），表明抑制小胶质细胞活化和增殖（图4A和B）。Iba1与M1和M2标志物的共染色表明，VNS显著偏斜小胶质细胞从主要表达iNOS转向表达CD206的表型（平均 % iNOS 表达小胶质细胞：Sham = 25.45 ± 4.14，VNS = 3.53 ± 1.66;n = 3，P = 0.008，平均 % CD206 表达小胶质细胞：Sham = 4.33 ± 0.39，VNS = 10.47 ± 2.22;n = 3，P = 0.053，Iba1iNOS和Iba1CD206之间的平均比率：Sham = 5.79 ± 0.47， VNS = 0.35 ± 0.18;n = 3，P = 0.0004）（图4B）。

图4。VNS减少小胶质细胞/巨噬细胞的活化和增殖，从促炎状态转变为促消退状态。（A）用小胶质细胞/巨噬细胞标志物Iba1免疫标记的EAE大鼠腰椎SC切片的代表性40X共聚焦图像，与M1表型标志物iNOS（促炎症）或M2表型标志物CD206（促溶解）共定位。（B）Iba1、iNOS和CD206的定量显示，与Sham相比，Iba1面积分数和iNOS Iba1群体的百分比显著降低，同时CD206 Iba1群体与VNS的百分比增加。数据以均值 ± SEM 表示。组均值 （n = 3）通过未配对的t检验进行比较。**P < 0.01，***P < 0.001。

VNS减少了致病性免疫细胞进入CNS

通过在0至2 DPSO上对CD66b阳性细胞进行免疫荧光染色来确定症状性疾病最初几天中性粒细胞浸润到CNS。与Sham组相比，VNS组CD66b中性粒细胞的数量显著减少（# CD66b 细胞/局灶区域±SEM：Sham = 34.94 ± 6.81，VNS = 5.16 ± 2.34，幼稚 = 0.70 ± 0.10;n = 2 至 4;Sham vs. VNS：P = 0.005，Sham vs. 朴素：P = 0.006，VNS vs. Naïve：P = 0.78）（图S5A和B）。采用免疫荧光和流式细胞术分析来确定在SC中观察到的EAE 峰值（3至4 DPSO）的细胞浸润是否由已知在MS和EAE中致病的淋巴细胞组成。用识别T淋巴细胞标志物CD4和细胞因子IL-17和IFN-γ的抗体对SC切片进行免疫荧光染色，显示Sham DNA 中IL-17和IFN-γ CD4 T细胞的数量高于VNS（图5A和B）。对分离的SC细胞进行白细胞标志物CD45以及CD4、IL-17和IFN-γ染色的流式细胞术分析也显示CD45/CD4/IL-17数量减少64.9 ± 5.6%（CD45 群体百分比，归一化为 Sham;平均 ± SEM，P = 0.0003）和CD45/CD4/IFN-γ 数量减少 63.0 ± 9.0%（CD45 种群百分比，归一化为Sham，VNS 大鼠与 Sham 大鼠相比，VNS大鼠的淋巴细胞平均值 ±，P = 0.095）（图5C和D）。总之，这些发现表明VNS通过减少病原细胞浸润到CNS来抑制病变形成和脱髓鞘。

图5。VNS在EAE高峰期减少病原性淋巴细胞进入 CNS。（A 和 B） 代表性的 20X 共聚焦图像显示 VNS SC 中 CD4、IL-17 和 IFN-γ 的存在减少。使用识别 CD4、IL-17、IFN-γ 和 DAPI 的抗体探测在疾病高峰期收获的 8 μm 腰椎 SC 切片。（C 和 D） 消化、分离、用抗体 （抗 CD45 、 CD4 、 IL-17 和 IFN-γ 探测） 腰椎 SC 细胞，并通过流式细胞术计数。VNS 减少了 CD45/CD4/IL17 和 CD45/CD4/IFN-γ 细胞。（C） 具有代表性结果的设门策略。（D） CD45/CD4/IL17 和 CD45/CD4/IFN-γ 细胞报告为 CD45 细胞的一部分，并标准化为 Sham。数据表示为均值 ± SEM，Sham CD45/CD4/IL17 （%CD45） = 33.3 ± 2.7，Sham CD45/CD4/IFN-γ 的平均 ± SEM = 18.5 ± 5.6。n = 3 到6。ns，不显著;P < 0.001 通过无配对t检验和Welch校正。

VNS调节参与Th1和Th17炎症途径、关键炎症反射成分和髓鞘合成的基因的表达

VNS组的EAE病程在VNS开始后24至72小时内与疾病控制和Sham的病程不同（0至2 DPSO;图1B）。为了探讨VNS如何影响EAE病理学的关键途径，对炎症反射的特征基因、参与Th1和Th17炎症途径的基因以及参与髓鞘合成和少突胶质细胞分化的基因进行了qPCR。致病性Th1和Th17活性的诱导剂Ifng 、Il12和Il17的基因表达水平在VNS大鼠中均显著下调（平均倍数变化标准化为Sham ± SEM：Ifng：0.05 ± 0.04，n = 4，P = 0.0002; Il12：0.29 ± 0.12， n = 4， P = 0.01;Il17：0.08 ± 0.06， n = 4， P = 0.001）（图6A）。Ifng 、 Il12和Il17的细胞因子基因表达水平与VNS在EAE中的保护作用一致。α7烟碱乙酰胆碱受体（Charna7）基因的表达显著增加（平均倍数变化标准化为Sham ± SEM：2.59 ± 0.35，n = 4，P = 0.02），β2肾上腺素能受体（Adrb2）和胆碱乙酰转移酶（Chat）的基因表达水平呈上升趋势（平均倍数变化归一化为Sham ± SEM：Adrb2：3.180 ± 0.75，n = 4，P = 0.062，Chat：2.425 ± 0.59 ， n = 4，P = 0.0966）（图6B）。髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, Mbp） 、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein, Mog）和蛋白脂蛋白（proteolipid protein, Plp）的基因表达水平，编码髓鞘的几个主要蛋白质成分，与少突胶质细胞分化和新髓鞘合成相关，在VNS大鼠中均显著上调（平均倍数变化归一化为Sham ± SEM：Mbp：2.35 ± 0.24，n = 4，P = 0.0105; Mog：3.47 ± 0.39，n = 4，P = 0.0078，Plp：3.23 ± 0.22，n = 4，P = 0.0021）（图 6C）。在Mbp启动子区结合的转录因子特异性蛋白1（Sp1）、SRY和转录因子10 （Sox10） 和 Pur-α （Pur α） 在VNS大鼠中均显著上调（平均倍数变化标准化为 Sham ± SEM：Sp1：1.81 ± 0.25，n = 4，P = 0.049; Sox10：2.02 ± 0.14，n = 4，P = 0.006，Pur α：2.88 ± 0.38，n = 4，P = 0.0158）（图 6D）。基因表达数据表明，VNS可能增强少突胶质细胞分化、髓鞘产生和炎性反射信号转导。

图6。VNS调节0至2DPSO的基因表达通路。从0至2 DPSO的腰椎SC中纯化RNA，并对目标基因进行定量PCR。（A） VNS调节Th1和Th17相关的炎症基因表达Ifng、Il12和Il17。（B)VNS调节关键炎症反射成分Adrb2、Chat和 Charna7的基因表达。（C）VNS上调Mbp、Mog、Plp、参与髓鞘合成和少突胶质细胞分化的基因和 （D） Mbp 基因转录因子 Sp1、Sox10 和 Pur α 的表达。（A-D） VNS介导的基因表达水平计算为肌动蛋白 β的相对倍数变化control基因并标准化为Sham（虚线）。数据以均值 ± SEM 表示。通过双尾未配对 t 检验和 Welch 校正分析Sham值的变化。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

结论和讨论

这些结果表明，VNS治疗通过防止病理性中性粒细胞和淋巴细胞浸润、髓鞘损伤、BBB破坏和纤维蛋白原沉积、小胶质细胞/巨噬细胞偏向修复表型以及有益修饰编码炎症介质的基因表达、炎症反射和髓鞘合成来降低大鼠 EAE疾病的严重程度和持续时间。

VNS治疗降低了MS标准大鼠EAE模型中疾病的严重程度和持续时间。VNS减少了星形胶质细胞活化，使小胶质细胞/巨噬细胞偏向分辨表型，维持了BBB完整性，减少了实质纤维蛋白原沉积，并调节了编码分泌性炎症介质成分的基因表达、炎症反射信号传导和髓鞘合成。VNS还减少了中性粒细胞和病理性T淋巴细胞的CNS浸润，并减少了炎症病变和脱髓鞘的范围。此外，与FDA批准的口服疾病修饰疗法（disease-modifying therapy, DMT）特立氟胺直接比较，VNS实现的EAE疾病严重程度和持续时间降低的幅度反映了特立氟胺达到的程度，这与之前在相同EAE Lewis大鼠模型中研究特立氟胺的出版物一致。EAE模型还为许多批准用于复发缓解型MS的药物开发提供了预测有效性，这些药物同样在EAE中证明了疗效。

VNS在大鼠EAE中的这些结果显示，在变构当量比批准用于人类的变构当量高2.1至4.1倍时，其治疗效果与MS药物特立氟胺相当，以及病理生理驱动因素和疾病相关性的改善。MS抑郁症的高终生发病率 （50%），以及已证明的VNS对抑郁症的疗效，支持VNS可能代表一种安全有效的长期疗法，不仅可以解决MS，还可以解决情绪障碍合并症。也许最具启发性的发现是VNS可以改变小胶质细胞表型以促进清除和修复，并上调参与髓鞘合成的基因表达，这表明VNS不仅可以改善炎症和疾病的临床症状，还可以增强髓鞘的形成和修复。目前正在进行其他动物模型研究，以进一步研究VNS独立促进髓鞘再生能力。

参考文献

声明

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