文献速递 | 耳迷走刺激可防止阿霉素诱导的心脏毒性并抑制肿瘤生长

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/ 2024.10.12

摘要：

阿霉素（Doxorubicin，Dox）由于其心脏毒性对患者构成相当大的威胁从而限制了其临床应用。需要最佳的心脏保护干预策略来抑制肿瘤生长，但也要最大限度地减少心脏副作用。本研究表明，与Dox组相比，耳屏迷走神经刺激（tragus vagus nerve stimulation，tVNS）改善不平衡的自主神经张力，改善心脏功能受损和纤维化，减轻肌细胞凋亡和线粒体功能障碍。柠檬酸甲酯（methyllycaconitine citrate，MLA）削弱了它的有益效果。转录谱显示有312个差异表达基因，tVNS的保护和MLA的延迟与炎症反应和NADPH氧化酶活性有关。此外，tVNS与Dox协同作用抑制肿瘤生长和肺转移，并以抗肿瘤免疫方式促进肿瘤细胞凋亡。这些结果表明，无创迷走神经调控可以在预防Dox诱导的心脏毒性和通过炎症和氧化应激抑制肿瘤生长方面发挥双重作用。

心率变异性（HRV）分析

通过HRV心电图(electrocardiogram，ECG)指标评估自主神经张力。每周使用Power Lab数据采集系统(AD Instruments, New South Wales, Australia)进行一次5分钟的II导联心电图记录。使用LabChart软件（8.0版，AD Instruments）进行分析频域（低频，0.15-1.5Hz;高频，1.5-5Hz）。

耳屏迷走神经刺激

tVNS是通过神经电刺激装置（ , China）进行的，与之前使用的方法相同。为小鼠选择的最佳频率和振幅是20-Hz和1-mA，其安全范围低于心率下降的10%。在tVNS伪刺激过程中，小鼠接受相同的过程，但没有受到电刺激。在真刺激过程中，tVNS会导致心率适度下降，不会导致任何不良反应但增加迷走神经传出活动。特别是在1.5%异氟醚麻醉下，每天在双侧外耳道进行30分钟占空比为1秒开1秒关的tVNS治疗（频率20Hz，振幅1mA，脉宽1ms）直至首次注射Dox4周后。

tVNS改善Dox诱导的心脏自主神经功能

选择的动物实验方案和参数如图1所示。为确定tVNS对自主神经张力的有效性，评估了各组小鼠的心率变异性（Heart rate variability，HRV）。与对照组相比，Dox显著降低高频（high frequency ，HF）（61.58 ± 4.27 对 75.83 ± 2.12 nu.，p < 0.0001），但低频（low frequency，LF）增加（36.68 ± 3.83 vs. 24.68 ± 2.34 nu.，p < 0.0001）和LF/HF（0.63 ± 0.11 对 0.33 ± 0.04，p < 0.0001）（图2A-2C）。对于Dox+tVNS组，tVNS阻止Dox诱导的这些变化并恢复到对照组。此外，柠檬酸甲基柠檬酸酯（MLA）的存在逆转这种保护作用。如图2D和2E所示，在Dox组中观察到血清乙酰胆碱（acetylcholine，ACH）水平显著降低（p < 0.001）和去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）水平显著升高（p < 0.0001），而Dox+tVNS与Dox组相比，Ach增加84.65%，NE水平降低17.8%，表明抗肾上腺素能作用。相反，MLA处理的小鼠显示出与Dox组相似的循环ACH（p = 0.48）和NE水平（p = 0.78）。此外，在用Dox治疗导致副交感神经去神经支配后，观察到心脏酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）交感神经纤维增加（图2F和2G）。这些结果表明，tVNS可以改善Dox诱导的交感神经过度活跃和迷走神经张力低下，而MLA可以阻断这种保护作用。

图1 无创经皮迷走神经刺激（tVNS）的研究方案和首选项设置

（A）研究设计、分组分配和终点的示意图。

（B）不同刺激强度下基线tVNS前后心率的变化（n = 5）。

（C）小鼠在基线和1mA主动tVNS期间的代表性心电图轨迹，表明在主动刺激期间RR间期适度延长。箭头表示刺激伪影。

（D）tVNS的最佳参数，20HZ频率和1mA振幅，脉冲宽度为1ms，占空比为1s，每天30min。

图2 tVNS影响心率变异性和心脏自主神经纤维神经支配改变

（A-C）使用快速傅立叶变换方法（n = 10）进行频域分析。LF，低频;HF，高频。

（D和E）各组血清乙酰胆碱（ACH）和去甲肾上腺素（NE）（n = 7）。

（F和G）心脏组织中TH交感神经密度的定量（n = 5），以及通过免疫组织化学评估的TH表达的代表性图像。TH， 酪氨酸羟化酶;IDO，积分光密度的平均值。（∗p < 0.05，∗∗p < 0.01，∗∗∗p < 0.001，∗∗∗∗p < 0.0001 vs.对照组;p < 0.01，p < 0.0001 vs. Dox 组;采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析进行统计分析。值表示平均值 ± SD）。

tVNS减轻Dox诱导的心功能障碍和心脏损伤

超声心动图是在最后一次Dox给药后进行的。与Dox组相比，tVNS组的LV射血分数（LV ejection fraction，LVEF）（68.72 ± 2.95 vs. 54.21 ± 2.87% , p < 0.0001）和左心室缩短分数（fractional shortening，FS）（33.48 ± 2.11 vs. 24.44 vs. 24.44 2.42%，p < 0.0001）显著改善，而这种效果被MLA治疗逆转（分别为 56.05 ± 3.47% 和 25.47 ± 2.50%）（图3A-3C）。Dox治疗导致每搏输出量（stroke volume，SV）下降，LV内径增加，tVNS治疗减弱内径扩张（补充信息，图S1A-S1C）。相反，与Dox+tVNS组相比，MLA组在收缩期（LV internal dimension in systole，LVIDs）和舒张期（LV internal dimension in diastole，LVIDd）中检测到LV内部尺寸显著增加，SV降低。此外，Dox治疗的小鼠心脏重量（标准化为胫骨长度）显著降低了18.3%，而tVNS治疗减轻这一点（6.55 ± 0.71 vs. 5.40 ± 0.37 mg/mm，p < 0.05）（图3D）。血清肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB）和心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）以及ANP和BNP的mRNA表达在Dox组中也显著增加，并且在用tVNS治疗的小鼠中恢复到对照水平（图3E-3G），而MLA明显阻断了这种作用，表明α7nAChR部分介导对心脏损伤的保护作用。

图3 tVNS缓解Dox诱导的心功能不全

（A）来自不同组的代表性M型超声心动图图像。

（B和C）分别对LVEF%和FS%进行超声心动图分析（n = 10）。LVEF%，左心室射血分数;FS%，左心室缩短分数率。

（D）根据胫骨长度（n = 6）标准化的心脏重量。

（E和F）各组在末次服用Dox或生理盐水后的血清肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）含量（n = 7）。

（G）不同组心脏组织中ANP和BNP的相对mRNA表达（n = 5）。（∗p < 0.05，∗∗∗∗p < 0.0001 vs. 对照组;p < 0.05，p < 0.01，p < 0.0001 vs. Dox组;采用Tukey多元比较检验的单因素方差分析进行统计分析。值表示平均值 ± SD）。

tVNS减轻Dox诱导的心肌细胞凋亡和线粒体功能障碍

Masson三色染色的代表性图像呈现由Dox诱导的间质和血管周围纤维化，胶原纤维被染成蓝色（图4A）。与Dox组相比，Dox+tVNS组LV的心脏纤维化降低（2.68 ± 0.68% vs. 12.52 ± 1.80%，p < 0.0001），而这种影响可以被MLA部分阻断（9.27 ± 1.71%）（图4B）。对不同组心脏组织的组织病理学检查显示，tVNS可显著改善Dox诱导的心肌纤维明显退行性变化和广泛的炎症浸润（图4C）。

图4 tVNS对心脏纤维化、炎症浸润和线粒体损伤的影响

（A）各组动物的组织学图像的代表性实例，其中Masson三色显示纤维化，上部为间质纤维化，下部为血管纤维化。

（B）纤维化面积的量化（以左心室面积的百分比表示;n = 5）。

（C）用苏木精和伊红染色的每组动物的组织学图像的代表性实例。

（D和E）TUNEL阳性细胞百分比（n = 5）的定量和不同组中TUNEL染色的代表性图像。

（F）心脏组织的透射电子显微照片和放大插图显示不同组的线粒体结构。（∗∗∗∗p < 0.0001 vs. 对照组;p < 0.01，p < 0.0001 vs. Dox 组;采用Tukey多元比较检验的单因素方差分析进行统计分析。值表示平均值 ± SD）。

此外，Dox增加末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口和标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick and labeling，TUNEL）阳性染色的心肌细胞数量，而tVNS可以保护心肌细胞凋亡（对照组、Dox组和Dox+tVNS组分别为0.94 ± 0.19% vs. 17.63 ± vs. 1.74 vs. 2.95 ± 0.58%）（图4D和4E）。鉴于线粒体结构对维持正常心肌功能的重要影响，研究tVNS是否会调节线粒体形态。对照组和tVNS组肌原纤维排列整齐，线粒体呈现不同形状和大小，伴有轻微增生。（图4F）。相反，Dox组小鼠的透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）图像显示线粒体明显受损，表现为中度肿胀、嵴断裂和缺失、基质空泡化和外渗。tVNS治疗后，受损的线粒体结构得到显著改善。然而，这种效果被MLA部分阻断，对比Dox组的影响要轻。这些数据表明Dox可以诱导心脏纤维化、肌细胞凋亡和线粒体损伤，而tVNS可通过α7nAChR依赖性方式减轻这些影响。

tVNS增强Dox的抗癌活性

研究者进一步探讨tVNS是否可以与Dox协同发挥抗肿瘤作用。通过生物发光成像（bioluminescence imaging，BLI）检测4T1-luc荷瘤BALB/c小鼠的肿瘤负荷，并用游标卡尺监测。值得注意的是，Dox+tVNS组在抑制肿瘤生长的趋势最好，Dox和MLA组表现出相似的抗肿瘤作用（图7A和S2）。BLI信号强度与肿瘤大小相关，但肿瘤坏死的出现会影响结果（图7B）。肿瘤生长测量显示肿瘤体积略有减少，tVNS组小鼠和对照组小鼠之间没有显著差异（p > 0.05）（图7C）。然而，Dox显著延迟肿瘤生长，与tVNS治疗联合使用可使肿瘤变小，而MLA则会阻断联合治疗的抗肿瘤作用（1439.0 ± 135.3 对 645.6 ± 78.9 对 336.3 ± 105.1 对 624.6 ± 150.6 毫米(3)在对照组中，分别为Dox、Dox+tVNS和MLA组）。处死小鼠以评估切除肿瘤的体积和重量，这也显示出Dox+tVNS组合有更好的抗肿瘤活性，并且与之前的分析一致（图7D和7E）。

图7 tVNS抑制肿瘤的生长和转移

（A）各组原发肿瘤的生物发光成像和（B）通过荧光素酶强度（n = 4）进行量化。

（C）不同小鼠组的肿瘤生长（n = 9-13）。

（D）脱落肿瘤的代表性图像。

（E）测量肿瘤重量以了解各组的肿瘤生长抑制（n = 5）。

（F）来自肿瘤组织的组织学图像的代表性示例;细胞核染成蓝色，细胞质和细胞外基质用苏木精和伊红（H&E） 染成粉红色。

（G）来自H&E染色的肺组织的组织学图像的代表性示例。

（H）肿瘤组织不同组 TUNEL 染色的代表性图像。（∗p < 0.05，∗∗∗p < 0.001，∗∗∗∗p < 0.0001 vs. 对照组;p < 0.05，p < 0.0001 vs. Dox 组;采用 Tukey 多重比较检验的单因素方差分析进行正态分布统计分析。值表示平均值 ± SD）。

此外，如图7F所示，在对照组的肿瘤切片中，肿瘤细胞紧密堆积且呈弥散性分布，而其他组则观察到不同程度的核萎缩和碎裂。单独使用tVNS会增加组织坏死和局灶性坏死，与Dox联合治疗可进一步加强。而MLA治疗则抵消这种强化效应。肿瘤组织中的TUNEL染色还表明，Dox+tVNS治疗引起的肿瘤细胞凋亡最为显著，而对照组仅发现少量细胞凋亡（图7H）。肺苏木精和伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色也发现了转移病灶受到显著抑制。Dox+tVNS中的肺泡腔比Dox组更明显。同时，占据空间的转移病灶比其他组更少、更小（图7G）。tVNS可以进一步影响肿瘤的局部自主神经支配地位（图8A）。尽管接受tVNS治疗，但MLA组的肿瘤浸润和肺转移与Dox组相似，都比Dox+tVNS组严重。鉴于协同抗肿瘤作用被MLA部分逆转，因此推测tVNS参与抗肿瘤免疫，从而减缓肿瘤进展。流式细胞术结果表明，Dox组肿瘤浸润T细胞（CD45CD3）的数量增加（图8B和8C）。特别是，Dox+tVNS中浸润T细胞的数量是Dox组的两倍。同样，Dox干预导致IFNγ表达增加和TGFβ表达降低，而tVNS干预增强这种效果，如图8D和8E所示。最终，这些结果表明Dox和tVNS的联合使用具有抑制肿瘤进展的能力。

图8 tVNS对肿瘤神经调控和炎症的影响

（A）通过免疫荧光在肿瘤组织中评估神经元标志物NF-L（绿色）和副交感神经元标志物VACHT（红色）。NF-L，神经丝-L;VACHT，囊泡乙酰胆碱转运蛋白。

（B）流式细胞术分选方案和代表性FACS图。

（C）CD45CD3细胞的相对定量（n = 5）。(+)(+)

（D和E）肿瘤组织中TGFβ和INFγ的相对mRNA 表达（n = 3）。（∗p < 0.05，∗∗∗p < 0.001，∗∗∗∗p < 0.0001 vs. 对照组;p < 0.05，p < 0.01 和 p < 0.001，p < 0.0001 vs. Dox 组;采用 Tukey 多元比较检验的单因素方差分析进行统计分析。值表示平均值 ± SD）。

参考文献

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