Science Advances | 迷走神经刺激免疫调节的机制新进展

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/ 2024.08.15

摘要

乙酰胆碱在脾脏中因迷走神经激活而产生。然而，对抗体产生的影响在很大程度上尚未得到探索。在本研究长期接收迷走神经刺激（vagus nerve stimulation，VNS）小鼠模型来研究VNS对T依赖性B细胞反应的影响。作者观察到高亲和力IgG滴度较低，抗原特异性生发中心（Germinal Center，GC）B细胞较少。来自长期接收VNS（4周）的小鼠的GC B细胞表现出mRNA和蛋白质表达的改变，表明细胞凋亡增加和浆细胞分化受损。滤泡树突状细胞（follicular dendritic cell，FDC）簇分散和基因表达改变表明功能减弱。产生乙酰胆碱的CD4 T细胞的缺失减少了这些改变。体外研究表明，α7和α9烟碱乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）直接调节B细胞产生肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF），而TNF是一种对FDC聚集至关重要的细胞因子。α4 nAChR抑制CD19与B细胞受体的结合，可能降低了B细胞的存活率。因此，VNS诱导的GC损伤可归因于nAChR对B细胞的不同影响。

内容简介

动物和临床研究已证明免疫的神经调节。神经系统控制免疫的机制和通路得到了深入研究，迷走神经是许多研究的重点。迷走神经的激活导致脾神经的激活，脾神经在脾脏中释放去甲肾上腺素。表达胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）的脾脏CD4 T细胞的一个特定亚群对去甲肾上腺素有反应，释放乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）。CD4 T细胞产生的ACh通过与α7烟碱乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）结合对脾巨噬细胞发挥免疫抑制作用。还知道几种烟碱和毒蕈碱ACh受体在淋巴细胞表面表达，但它们的免疫调节作用研究较少。

迷走神经在不同的炎症条件下被激活，包括败血症。在脓毒症的急性期，迷走神经免疫通路的参与是有益的，因为它抑制可能有害的炎症来保护器官功能。然而之前发现在败血症后小鼠中迷走神经激活增加持续存在，导致脾巨噬细胞对脂多糖（LPS）的反应性降低。作者还报告了脓毒症后小鼠的生发中心（GC）反应受损。抗原激活的B细胞产生的肿瘤坏死因子（TNF）减少与滤泡树突状细胞（FDC）分散和使用T依赖性（T-dependent，TD）抗原免疫后高亲和力抗原特异性抗体滴度较低有关。临床研究还表明与未经历败血症的人相比，脓毒症幸存者的体液反应不足，疫苗反应差，感染导致的5年生存率较差。这些观察结果使研究者假设迷走神经刺激（VNS）会改变GC反应。

GC的形成是抗体反应成熟过程中的关键过程。GC是次级淋巴器官中响应抗原暴露而形成的特殊微结构。抗原激活后，滤泡（follicular，FO）B 细胞与FDC簇和T滤泡辅助细胞（T(FH系列)）单元格。FDC将抗原呈递为免疫复合物，而T(FH系列)细胞向GCB细胞提供激活信号，如白细胞介素 21 和共刺激分子。在GC中，B细胞进行基于亲和力的选择并分化为分泌抗体的浆细胞（plasma cells，PCs）和记忆B细胞。尽管B细胞表达α4β2、α7和α9同聚体nAChR，但迷走神经对GC反应的调节尚未得到探索。关于B细胞上nAChR 功能的体内研究很少：Zhang等人报告了α9 nAChR对PC扩增的贡献，而Fujii等人显示了α7 nAChR对抗体产生的潜在影响。一项体外研究表明，这些受体会影响B细胞内的不同通路，但目前对调节B细胞功能的神经机制的理解仍然很初级。关于体内对B细胞影响的研究有限的原因之一是长期操纵迷走神经激活的困难。

本研究通过使用长期接收VNS小鼠模型，迷走神经激活在使用TD抗原免疫后产生降低的抗体反应。接受长期VNS的小鼠产生较低的高亲和力抗体滴度。他们还表现出较少的抗原特异性GC B细胞数量，并减少了FDC聚集。去除ChAT CD4 T细胞后，长期接受VNS的抑制作用减弱。此外通过体外研究证明，ACh直接作用于B细胞以减少TNF产生和B细胞受体（BCR）信号传导，这两者对于产生有效的GC反应都至关重要。敲低α7和α9 nAChR亚基抵消了TNF产生的减少，而敲低α4亚基恢复了BCR诱导的Akt磷酸化。nAChR亚型的这些不同功能协同作用以抑制GC反应。这些结果揭示了在迷走神经激活增加的情况下B细胞反应迟钝的一个潜在机制，并提出了一种调节适应性免疫反应的潜在治疗方法。

结果

长期接受VNS会减少抗原特异性GC B细胞

长期接收VNS降低了NP特异性GC B细胞的频率（图1G）。这些数据表明，长期接收VNS会导致TD抗原特异性GC反应减弱，同时高亲和力抗体产生较少。

长期接收VNS阻碍GCB细胞的成熟和存活

这些发现表明，长期VNS小鼠中的GC B细胞表现出与存活受损和向PCs分化一致的转录程序，这将有助于我们观察到的NP特异性GC B细胞反应减少。

长期VNS损害FDC组织

讨论

在本研究中，探讨了长期VNS对TD抗原的B细胞反应的影响。观察到长期VNS引发高亲和力抗体反应减弱、特异性GC B细胞数量减少。长期VNS小鼠的GC B细胞呈现更高程度的凋亡倾向和PC分化障碍。此外，FDCs分布不均，基因表达模式也发生改变。在尼古丁存在时，CpG刺激后B细胞分泌的TNF减少，并且BCR刺激后B细胞Akt磷酸化水平下降。敲除实验结果显示，α7和α9 nAChR通过调节NF-κB转位来调控TNF转录；而α4β2 nAChR则通过物理阻断BCR和CD19共定位来限制Akt磷酸化过程。总之，数据提示：长期VNS小鼠GC反应不佳至少由两种不同机制引起：一是由于B细胞释放的TNF导致FDC功能改变；二是由于BCR-CD19核心受体复合物形成受阻导致Akt信号通路损伤及B细胞存活能力下降。

很少有研究调查体液免疫反应的神经调节。与本研究发现一致，α4β2 nAChR被报道位于BCR附近。同样值得注意的是，nAChR的跨膜结构域TM4被认为是一种脂质传感器，影响周围的膜脂组织，特别是脂质筏。因此，研究者有理由推测乙酰胆碱可能通过作用于BCR后的脂筏来调节BCR复合物。α7 nAChR是研究最广泛的免疫神经调节受体之一。全球α7 nAChR KO小鼠显示血清卵清蛋白特异性IgG1水平升高，与本研究结果一致。此外，α7 nAChR已被证明对NF-κB转运到细胞核和巨噬细胞释放TNF具有抑制作用，特别是在内毒素血症的情况下。巨噬细胞上的α7 nAChRs是否像本研究在B细胞中观察到的那样调节内体TLR通路，尚未被研究。先前也有报道称α7和α9 nachr不参与bcr介导的激活。与这些发现相反，Zhang等人报道α9 nachr有助于GC后PC扩增。研究结果表明，脾神经通过α9 nachr促进PC扩张，而不影响GC B细胞群。他们的研究与本研究的区别在于，本研究方法是在免疫前14天长期应用VNS，导致免疫时FDC分散，他们的研究中没有此观察。此外，本研究基于之前的研究发现采用了每日两次，每次5分钟的VNS方案，该方案降低了血清TNF水平，以响应LPS。本治疗方案抑制了GC反应，但不同的VNS参数对体液免疫的作用可能不同。在本研究中发现不同的nachr发挥着不同的作用。鉴于这些受体的结合亲和力不同(44)，乙酰胆碱暴露的结果可能取决于乙酰胆碱释放量。

FDC弥散的研究结果与作者之前在脓毒症后迷走神经组成性激活的小鼠中发现的结果一致，表明迷走神经在损害FDC中起作用，从而抑制体液免疫。然而必须承认的是，在本研究中长期接收VNS并没有完全复制脓毒症后的情况。脓毒症后小鼠显示出更明显的抗体产生抑制，影响高亲和力和低亲和力抗体。这可能表明有其他机制或迷走神经活动增强。

同样重要的是要认识到在长期接收VNS中可能有其他神经递质和细胞类型在起作用。据报道，去甲肾上腺素和多巴胺也因VNS而增加，免疫细胞包括B细胞具有这些分子的受体。由于具有chat缺陷CD4 T细胞的小鼠仅显示VNS效应部分消失，因此其他途径可能在模型中发挥作用。有趣的是，Suzuki等人发现β2肾上腺素能受体通过与趋化因子受体的物理相互作用阻止T细胞和B细胞从淋巴结排出。此外，T+FH细胞可能参与VNS介导的GC反应变化，因为CD4 T细胞也表达nachr和肾上腺素能受体。作者发现长期接收VNS小鼠ChAT CD4 T细胞CXCR5表达增加(图S4A)，表明长期接收VNS可能影响这些细胞在脾脏内的迁移，最终有助于调节GC反应。

本研究以未植入cuff的电极小鼠作为假对照。这一决定是基于之前的观察，即cuff本身的存在对LPS的急性TNF反应没有任何明显的影响。先前在大鼠中使用长期迷走神经刺激的研究显示，在假刺激组中，植入迷走神经cuff的对照动物没有抗炎作用，包括对靶组织中TNF水平没有影响。此外，一项小鼠研究表明，急性钩住或机械操作迷走神经不会导致LPS攻击后TNF的抑制。

值得注意的是，颈椎迷走神经是所有传入和传出迷走神经纤维交汇的地方，对它的刺激涉及到几个自主神经回路和反射，而在本研究中没有评估这些回路和反射的激活。其中一些通路，包括投射到腹腔神经节的内脏神经的节前神经、交感神经纤维，可能与本研究报道的长期迷走神经的影响有关。他们的贡献将在未来的研究中确定。

总之，作者已经揭示了迷走神经调节体液免疫的途径。这些发现在逆转不希望的免疫抑制或减少GC衍生的旺盛自身抗体反应方面具有潜在的临床意义。改变迷走神经的活动可能是扭转这种免疫抑制状态的一种新的治疗策略。

材料和方法（VNS电极植入与长期刺激方案）

迷走神经和心电图电极植入术

商用微型cuff电极（100-μm microsling, CorTec, Germany）和铂铱合金导线集成到纳米带连接器（Omnetics）上。将cuff电极植入左颈迷走神经，并将铂铱合金导线皮下拴在胸壁上以记录心电图，如前所述。简而言之，用3%至4%异氟烷诱导麻醉，并用1.5%维持麻醉。在加热的手术垫上，暴露颅骨背侧的一个区域并用生理盐水和过氧化氢擦洗，并形成一条通往腹颈的皮下隧道。通过腹颈切口暴露颈动脉鞘，轻轻解剖左迷走神经脱离鞘。将cuff电极和心电图电极通过颅骨切口隧道连接到腹颈，然后将cuff电极小心地放置在迷走神经上并嵌入颈部肌肉组织下方。将心电图电极通过腹颈和左侧肋下切口皮下缝合到上胸壁和下胸壁。然后将条状连接器粘合到颅骨上，并用手术胶水密封。手术是在严格的无菌技术下进行的。小鼠在整个过程中补充生理盐水，并在术后用美洛昔康（5mg/kg）治疗。在开始长期VNS之前，允许小鼠恢复大约一周。

长期接收VNS

小鼠被单独饲养在定制的笼子中（图1A），每个笼子包括一个透明的亚克力圆柱体（直径15.24厘米，高20.32厘米），一个三维打印的通风塑料盖，带有集成换向器系统（P1 Technologies）和一个水瓶。笼子的地板上提供食物和巢穴材料，每周更换一次。在接受植入手术之前，小鼠在这些笼子中适应了1周，并继续被安置家庭笼子中直到实验结束。恢复1周后，小鼠通过一根允许自由移动的柔性电缆连接到换向器。换向器系统连接到位于笼外的电池供电的刺激/记录系统[Neurochip3]，并使用刺激参数和时间表进行编程。定制的笼子被放置在一个移动站上，并以12小时的光/暗循环安置在小鼠饲养室中，可以随意获取食物和水。小鼠使用以下参数每天接受两次刺激（间隔6小时）：500μs脉冲宽度、30Hz频率、5分钟，电流强度导致基线心率降低~20%至30%。每天审查记录的心电图来监测刺激电极的功能并调整刺激强度，在整个VNS期间保持一致的心率反应。每天对小鼠进行监测，观察健康状况的指标，包括食物和水的消耗以及巢穴的建造。在VNS的第2周和第3周（图1B），在异氟烷麻醉下通过尾尖取样收集血液进行血清学测定。在VNS第4周结束时，对小鼠实施安乐死，并收集脾脏和血液进行分析。

参考文献

声明

最新VNS文献

1.Transcutaneous vagus nerve stimulation effects on chronic pain: systematic review and meta-analysis

经皮迷走神经刺激对慢性疼痛的影响：系统评价和荟萃分析

https://journals.lww.com/painrpts/fulltext/2024/10000/transcutaneous_vagus_nerve_stimulation_effects_on.1.aspx

2.Advances in VNS efficiency and mechanisms of action on cognitive functions

VNS效率及其作用机制对认知功能的研究进展

https://www.frontiersin.org/journals/physiology/articles/10.3389/fphys.2024.1452490/abstract

3.Vagus nerve stimulation (VNS) preventing postoperative cognitive dysfunction (POCD): two potential mechanisms in cognitive function

迷走神经刺激 （VNS） 预防术后认知功能障碍 （POCD）：认知功能的两种潜在机制

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39138750/#:~:text=In%20POCD%20model%2C%20the%20enhancement%20of%20cognition%20function,two%20potential%20mechanisms%3A%20the%20inflammatory%20microenvironment%20and%20epigenetics.

4.Vagal nerve stimulation potential therapeutic benefits in acute lung rejection and transplantation

迷走神经刺激在急性肺排斥反应和移植中的潜在治疗益处

https://doi.org/10.1016/j.trim.2024.102105

5.The effect of in-ear and behind-ear transcutaneous auricular vagus nerve stimulation on autonomic function: a randomized, single-blind, sham-controlled study

耳内和耳后经皮耳迷走神经刺激对自主神经功能的影响：一项随机、单盲、假对照研究

https://doi.org/10.3390/jcm13154385